在成像時保持染料的光譜重疊盡可能低至關(guān)重要，但在如此高密度的多標記樣本中，串色無法wanquan避免。

在這種超多標水平上，拆分工具提供了一種識別和量化每個標記物貢獻的方法。

傳統(tǒng)方法中，單獨染色一個樣本（每個標記物一個）作為拆分的對照和起點。對照樣本中獲取的信息用于構(gòu)建拆分矩陣。單染色方法比較繁瑣，因為這需要大量的樣本和精力，來創(chuàng)建與多重標記數(shù)量相同數(shù)量的樣本。

計算出拆分矩陣后，使用相應(yīng)的設(shè)置對完整的15標樣本進行采集。拆分后的數(shù)據(jù)會自動生成（圖 3），并附上對應(yīng)的原始圖像，方便后續(xù)分析和解釋。帶有所有生物相關(guān)通道的樣本片段展示了單輪染色方法的豐富信息（圖3a）。

癌癥樣本的詳細視圖展示了不同的微環(huán)境。例如，富含淋巴細胞的區(qū)域（B 和T細胞）展示了免疫系統(tǒng)在腫瘤中已經(jīng)開始執(zhí)行功能（圖3b）。這些淋巴細胞大多具備免疫功能，直接或間接抵抗腫瘤生長（圖3c中TCF1和PD1的表達），其中部分細胞還具有調(diào)節(jié)作用（圖3c中FoxP3的 表達）。髓系細胞在腫瘤中通常更為常見，功能各異，可發(fā)揮抗腫瘤或促腫瘤作用，其空間分布在很小尺度上呈現(xiàn)顯著差異（圖3d）。

樣本中的癌癥、基質(zhì)和細胞外基質(zhì)標記物表現(xiàn)出較高的異質(zhì)性。雖然這些標記物的分布較為復雜（例如，成纖維細胞的細胞過程），但它們也明顯覆蓋了大片上皮和內(nèi)皮細胞區(qū)域（圖3e–g）。高級拆分程序確保在組織內(nèi)準確識別不同的細胞類型及其功能狀態(tài)（例如，免疫細胞亞型、組織決定因子和疾病決定因子）。

總體而言，建立一種穩(wěn)健、快速且靈活的3D成像方法以評估癌癥組織對于解析腫瘤微環(huán)境的變化至關(guān)重要。該成像工作流程的高效性可以加速結(jié)果評估、決策制定，并為后續(xù)實驗設(shè)計提供有力支持。

一次性成像方法為此工作流程帶來了兩項關(guān)鍵優(yōu)勢。首先，能夠?qū)εc癌癥標記物相關(guān)的感興趣區(qū)域（ROIs）進行深入探索，例如在不同放大倍數(shù)和更高分辨率下進行更詳細的空間特征分析。其次，所有標記物在三維環(huán)境中同時存在，確保在組織中發(fā)現(xiàn)的相互作用置于其預(yù)期或意料之外的組織微環(huán)境中進行分析。

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