免疫系統(tǒng)對(duì)癌癥治療的反應(yīng)可以反映患者在治療之后是否會(huì)有良好的結(jié)果。了解腫瘤微環(huán)境（TME）在腫瘤發(fā)生和治療反應(yīng)中的變化對(duì)制定個(gè)性化的治療方案并改善癌癥治療至關(guān)重要。借助穩(wěn)定和全面的超多標(biāo)成像技術(shù)，可使用免疫標(biāo)志物探查髓系和淋巴系細(xì)胞的譜系和結(jié)構(gòu)，而且結(jié)合特定腫瘤生物標(biāo)志物時(shí)，還可以捕捉多種腫瘤中TME內(nèi)的免疫反應(yīng)。細(xì)胞類(lèi)型特征模式，結(jié)合超多標(biāo)組織成像的探查能力，可以針對(duì)免疫細(xì)胞群和TME內(nèi)眾多類(lèi)型細(xì)胞的空間相互作用提供之前無(wú)法獲得的全新認(rèn)識(shí)。

Cell DIVE超多標(biāo)成像分析整體解決方案可以使用循環(huán)染色和染料失活流程對(duì)一個(gè)完整組織切片上的數(shù)十個(gè)生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)和成像。Cell DIVE的核心是一個(gè)精確、靈活、開(kāi)放的多標(biāo)記成像解決方案，可以靈活選擇多標(biāo)記成像研究中常用的生物標(biāo)志物抗體。Cell Signaling Technology(CST)擁有豐富的經(jīng)IHC驗(yàn)證的抗體組合，可檢測(cè)TME中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，實(shí)現(xiàn)組織中的免疫細(xì)胞檢測(cè)和表型判斷。CST提供抗體偶聯(lián)物，這些偶聯(lián)物均經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，可用于Cell DIVE上，并提供經(jīng)IHC驗(yàn)證抗體與熒光團(tuán)和其他檢測(cè)試劑的定制化偶聯(lián)。CST采用嚴(yán)格的IHC驗(yàn)證方法，隨后還會(huì)在Cell DIVE平臺(tái)上進(jìn)行驗(yàn)證，可確保成功檢測(cè)蛋白質(zhì)。

在本研究中，我們展示了使用由數(shù)十種CST生物標(biāo)志物抗體^™組成的新型檢測(cè)模式，在多種組織類(lèi)型中進(jìn)行的Cell DIVE超多標(biāo)成像。多標(biāo)記檢測(cè)模式的開(kāi)發(fā)所需的優(yōu)化極少，可識(shí)別復(fù)雜的細(xì)胞類(lèi)型，并揭示腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間相互作用。

表征腫瘤微環(huán)境有助于理解導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的新機(jī)制。腫瘤微環(huán)境比較復(fù)雜，通常在單個(gè)樣本和不同患者樣本中都是異質(zhì)的。循環(huán)多標(biāo)記染色和成像可在不同組織樣本中實(shí)現(xiàn)TME探查，即使可用組織有限的情況下。在這項(xiàng)研究中，我們檢查了12個(gè)完整組織或TMA切片中30多個(gè)生物標(biāo)志物的表達(dá)（表1），重點(diǎn)是潛在的免疫治療目標(biāo)、預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物和分割標(biāo)志物。所有的CST生物標(biāo)志物抗體均被連接并隨機(jī)分配到一個(gè)回合。

為了在TME中其他細(xì)胞的背景下定義免疫細(xì)胞，融合并分割了所有的生物標(biāo)志物圖像，并使用聚類(lèi)分析和降維（UMAP）對(duì)表達(dá)進(jìn)行分析。聚類(lèi)分析提供了一個(gè)無(wú)偏見(jiàn)的方法來(lái)定義組織內(nèi)的免疫細(xì)胞貢獻(xiàn)。

在這項(xiàng)研究中，我們展示了人類(lèi)結(jié)腸腺癌（CAC；圖1）的聚類(lèi)分析。在這里，聚類(lèi)分析將白細(xì)胞從所有其他上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型中區(qū)分出來(lái)（圖1C）。此外，聚類(lèi)清楚地定義了淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞類(lèi)別。CAC中的骨髓類(lèi)亞型包括骨髓祖細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和另外兩個(gè)未知亞型的骨髓聚類(lèi)。其他生物標(biāo)志物可用于進(jìn)一步定義亞型。對(duì)于淋巴類(lèi)，定義了T細(xì)胞和NKT細(xì)胞聚類(lèi)。另外，還確定了一個(gè)具有CD20陽(yáng)性的T細(xì)胞聚類(lèi)。使用機(jī)器學(xué)習(xí)進(jìn)行單細(xì)胞表型分析，可以從聚類(lèi)中進(jìn)一步定義細(xì)胞類(lèi)型。例如，在圖像1D中，聚類(lèi)15中的一個(gè)細(xì)胞是CD45+ CD3+ CD8+ CD4+ GRZB+ Ki67+ LAG3+ PD1+TIM3+（圖1D-E；橙色圈）。聚類(lèi)和單細(xì)胞空間分析被應(yīng)用于研究中的所有其他組織（圖2；數(shù)據(jù)未顯示）。

CST抗體經(jīng)過(guò)了嚴(yán)格的驗(yàn)證，以確?？贵w在FFPE組織上的表現(xiàn)。本研究中的所有抗體都是直接偶聯(lián)或商業(yè)偶聯(lián)物成品（表1）。偶聯(lián)是使用非位點(diǎn)特異性化學(xué)方法進(jìn)行的?？贵w與四種不同的染料過(guò)量偶聯(lián)，去除未結(jié)合的染料，并通過(guò)分光光度分析測(cè)量標(biāo)記的程度。經(jīng)過(guò)初步驗(yàn)證，具有*佳標(biāo)記程度和濃度的偶聯(lián)抗體溶液隨后用于對(duì)各種人類(lèi)癌癥組織和正常組織的染色。組織從商業(yè)來(lái)源獲得（Pantomics；表1）。在Cell DIVE上使用四通道+DAPI對(duì)組織進(jìn)行成像，并自動(dòng)進(jìn)行自發(fā)熒光去除、校正和拼接。使用徠卡顯微系統(tǒng)開(kāi)發(fā)的zhuanli軟件全拼接圖像進(jìn)行導(dǎo)入、融合和分析。